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Proteomica in Allergologia

Proteomica in Allergologia

 Proteomica applicata all'allergologia


Proteomica in Allergologia

Enrico SCALA

Introduzione

La risposta immune fisiologica porta alla tolleranza nei confronti delle proteine che si trovano nell’ambiente. Una deviazione della risposta immune, nella maggior parte dei casi IgE mediata, è alla base dell’ insorgenza di una diatesi allergica. Non è noto quale sia la reale incidenza delle malattie allergiche, anche se si stima che all’incirca un terzo della popolazione totale ne sia coinvolta. Il continuo aumento di tali patologie ha causato un incremento sia diretto che indiretto di costi per il Sistema Sanitario Nazionale (in Germania 5 bilioni di euro). Quanto sopra ha rappresentato un enorme impulso allo sviluppo di metodiche più efficienti di diagnosi primaria e di misure di prevenzione secondaria.

 

Diagnosi allergologica

Per un corretto inquadramento allergologico è necessaria in prima istanza una approfondita anamnesi specialistica associata ad un’attenta disamina clinico-fisica del paziente. Qualora venga sospettata una reazione IgE mediata, vanno eseguiti test sia in vivo che in vitro.  La diagnosi delle malattie allergiche è stata fino ad oggi basata sul dosaggio in vitro di IgE specifiche verso gli allergeni presenti in un determinato estratto e sullo scatenamento di sintomi immediati tramite test di provocazione in vivo (test cutanei, test di provocazione congiuntivale, nasale, bronchiale) sempre con materiali ottenuti da svariate fonti allergeniche. Ogni estratto allergenico viene ottenuto dall’estrazione acquosa di una determinata fonte biologica. Ogni estratto è formato da una miscela di molecole allergeniche e non allergeniche. I test in vitro sono estremamente costosi. I test consigliati per una corretta indagine allergologica in vitro, infatti, implicano l’esecuzione di all’incirca 10-20 dosaggi / individuo ad un costo medio di 10 €/determinazione (dai 100 ai 200 € complessivi) per ottenere informazioni, tutto sommato, limitate.

Nella pratica clinica le malattie allergiche vengono pertanto a tutt'oggi diagnosticate impiegando estratti allergenici scarsamente caratterizzati e di variabile stabilità. Conseguenza di ciò è che gli attuali strumenti diagnostici, prodotti da varie industrie, non sono praticamente mai paragonabili o raffrontabili l’un l’altro. Una corretta standardizzazioni degli estratti è infatti un prerequisito esiziale per l’esecuzione di test su patologie IgE medate.

L’impiego di un estratti allergenici permettono di fare diagnosi di allergia verso una data fonte allergenica, ma non forniscono alcuna informazione su quale sia la componente molecolare responsabile della sintomatologia, o sulla patogenesi della  risposta immunologica.

 

Allergen Microarray

L’avvento della proteomica e la recente disponibilità di  allergeni ricombinanti o purificati sia per intenti diagnostici che per una immunoterapia specifica rappresentano un importante evoluzione nella diagnostica delle allergopatie di tipo I.

La tecnologia delle micro serie su microchip permette il dosaggio simultaneo di un gran numero molecole allergeniche purificate, rappresentative delle più comuni fonti

allergeniche. Le nanotecnologie (allergen Microarray), consentono, infatti, di coniugare centinaia di proteine e/o molecole allergeniche contemporaneamente su di un’unica fase solida estremamente piccola, utilizzando piccoli volumi (nanolitri) di allergeni. Vengono così utilizzate solo minime quantità di ogni molecola, la qual cosa permette un notevole abbattimento dei costi. Con un unico test, in tal modo, è possibile ottenere informazioni oltremodo più compete di quelle accessibili ad oggi a costi infinitamente più bassi. L’allergen microarray, infatti, permette di determinare e monitorare i profili di reattività dei soggetti allergici, nei confronti un notevole numero di allergeni, utilizzando minute quantità di siero (dai 25 ai 50µl), aspetto che riveste particolare importanza nella allergologia pediatrica, nei follow-up dei pazienti in trattamento e nello screening dei gruppi familiari ad alto rischio di sviluppare patologie allergiche.

 

Note Tecniche

I vetrini impiegati nel test contengono un reattivo amminico idoneo al legame covalente con le proteine. Gli allergeni purificati o le molecole ricombinanti vengono diluiti in 150 mM di una soluzione salina tamponata, contenente 0.1% di dodecilsofato sodico, ad una concentrazione finale di 0.3 mg/ml. Le soluzioni di allergene così ottenute vengono dispensate su vetrini pre-attivati. Tali fasi solide vengono poi incubate col siero del paziente opportunamente diluito, per 60-180 minuti a 37° C. Le IgE specifiche legate all'allergene vengono successivamente riconosciute tramite un anticorpo monoclonale di topo anti-IgE

umane (diluito 1:1000) marcato. Infine, le molecole allergeniche vengono

valutate utilizzando uno scanner (Affimetrix). Solo piccoli quantitativi di

siero sono necessari per evidenziare la presenza di IgE specifiche per oltre 100 differenti  allergeni. Le procedure diagnostiche attualmente in uso necessitano di 50 µl di siero per

valutare un solo estratto allergenico.

 

Vantaggi della metodica 

L'approccio molecolare esteso permette un inquadramento oggettivo della reattività del paziente, indipendentemente dalla sua capacità di riferire segni e sintomi soggettivi. La notevole mole di dati informativi che verrà prodotta sarà seconda forse solo a quella attualmente disponibile per la genomica. Sarà possibile in futuro

aumentare la sensibilità dell'allergen micro-array impiegando miscele di anticorpi

monoclonali anti-IgE umane o utilizzando altre tecniche di amplificazione (rolling circle,

DNA amplification).

Rispetto alla diagnosi sierologica basata sull'impiego di estratti allergenici, la tecnica che utilizza allergen microarray con molecole ricombinanti offre molti vantaggi.

·        Il test permette di definire un profilo di reattività verso un gran numero di molecole allergeniche differenti, tramite un'unica e rapida procedura diagnostica.

·        Il fatto che siano necessarie solo piccole quantità di siero è particolarmente importante (i.e. nel monitoraggio all'esordio e nei follow up delle patologie IgE mediate della prima infanzia).

·        Non vi è alcun ipotetico limite alla applicazione su fase solida anche di diverse migliaia di molecole allergeniche ricombinanti, native, epitopi, o di molecole rilevanti che si rendano di volta in volta disponibili.

·        E' possibile con questa tecnologia monitorare profili di reattività individuali durante il decorso della malattia allergica o durante trattamenti specifici. L'identificazione di tali profili può consentire una correlazione tra determinati  profili di reattività e parametri clinici specifici (i.e. progressione da rino-congiuntivite ad l'asma, o sensibilizzazione a nuovi allergeni).

·        Possibilità di monitorare l'eventuale ruolo protettivo di immunoglobuline di altre classi e sottoclassi diverse dalle IgE valutando in dettaglio la loro specificità per allergeni o epitopi.

·        La definizione di un 'allergo-gramma individuale, tramite allergen micro-array test, permetterà di calibrare le terapie convenzionali e svilupparne di nuove allergene mirate.

 

References

Deinhofer K, Sevcik H, Balic N, Harwanegg C, Hiller R et al. 2004. Microarrayed allergens for IgE profiling. Methods 32(3):249-54

Harwanegg C, Hiller R. 2004. Protein microarrays in diagnosing IgE-mediated diseases: spotting allergy at the molecular level. Expert. Rev. Mol Diagn. 4(4):539-48

Hiller R, Laffer S, Harwanegg C, Huber M, Schmidt WM et al. 2002. Microarrayed allergen molecules: diagnostic gatekeepers for allergy treatment. FASEB J 16(3):414-6

Kingsmore SF, Patel DD. 2003. Multiplexed protein profiling on antibody-based microarrays by rolling circle amplification. Curr. Opin. Biotechnol. 14(1):74-81

Kricka LJ, Joos T, Fortina P. 2003. Protein microarrays: a literature survey. Clin. Chem. 49(12):2109

Creato da:  Dott. Enrico Scala

Data pubblicazione:   03/12/10
 
 

Informazioni sullo studio

Dott. Enrico Scala

Allergologia

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